首先我们来了解一下什么是 western blot 实验它主要能用于那些科研的设计当中，以及这个实验的操作难度在哪里？有哪些需要注意的地方呢？  

利用特定抗体能够专一结合其抗原蛋白质的原理来对样品进行着色，通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息，来分析检测特定蛋白质的生物学检测技术。

它有那些其他的名称呢？
「蛋白质转渍法」、「免疫印迹法」（immunoblot）或「西式吸印杂交」。

主要用于那些领域的科研？
分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法，也是 HIV 检测的方法之一。

实验的步骤 
实验大致分为铸胶、跑胶、转渍、接一级抗体、接二级抗体以及压片几个部分。

组织准备 
样品可以从整个组织中或从细胞培养物中提取。固体组织首先使用（对于较大样品体积）搅拌机的机械方式打破，使用均化器（小体积），或通过超声处理。

在蛋白质样品的制备过程中要需要区分的几点是

1.单层贴壁细胞细胞总蛋白的提取

2.组织中总蛋白的提取

3.加药物处理的贴壁细胞总蛋白

不同的组织样本都有不同的提取方法。

在组织的准备过程中要注意蛋白质的提取方面出问题是 wb 实验发生失败的一项大的障碍，毕竟这些后续的实验都是基于提取到好的蛋白质的前提下所以我们要做到以下几点

1.要尽可能的获取所有的蛋白质特别是对于低丰度目的蛋白。裂解细胞/组织时防止蛋白降解，从复杂的样品进行分离和精制 (比如分部富集/去除高丰度蛋白，coIP/IP) 等策略，都是保障有足够目的蛋白进入下一步的关键。

2.还有一定要注意到在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。另外，防止蛋白质在样品处理过程中的人为的修饰，制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰 (加入合适的蛋白酶抑制剂)。




蛋白质含量测定

一、制作标准曲线

1、从-20℃ 取出 1 mg/ml BSA，室温融化后，备用。

2、取 18 个 1.5 ml 离心管，3 个一组，分别标记为 0 μg，2.5 μg，5.0 μg ，10.0 μg ，20.0 μg ，40.0 μg。

3、按下表在各管中加入各种试剂。

4、混匀后，室温放置 2 min。在生物分光光度计上比色分析。


二、 检测样品蛋白含量

1、取足量的 1.5 ml 离心管，每管加入 4℃ 储存的考马斯亮蓝溶液 1 ml。室温放置 30 min 后即可用于测蛋白。

2、取一管考马斯亮蓝加 0.15mol/L NaCl 溶液 100 μl，混匀放置 2 分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按 blank 测空白样品。

3、弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯 2 次（每次 0.5 ml），再用无菌水洗一次。

4、取一管考马斯亮蓝加 95 μl 0.15mol/L NaCl NaCl 溶液和 5μ 待测蛋白样品，混匀后静置 2 min，倒入扣干的比色杯中按 sample 键测样品。

注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗 2 次，无菌水洗一次。可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。测得的结果是 5 μl 样品含的蛋白量。


凝胶电泳

样品的蛋白质是使用凝胶电泳分离。蛋白质的分离可通过等电点（pI），分子量，电荷，或这些因素的组合。分离的性质取决于样品的处理和凝胶的性质。这是识别蛋白质非常有用的方法。另外，也可以使用一个两维（2-D）的凝胶在两个维度上来传播来自单个样品的蛋白质。蛋白质在第一维分离是根据它们的等电点（pH 为它们具有的中性净电荷），并在第二维分离是根据它们的分子量。

电泳时则需要注意到

1：上样时，根据蛋白表达丰度调整蛋白上样量，尽量保证每孔上样量保持一致。

2：胶最好现配现用，如果需要保存，最好用湿润的保鲜膜包好并置于 4℃ 冰箱中




转渍（转膜）

要让抗体成功对蛋白质产生反应，就要将蛋白质从凝胶中转移到用硝化纤维或 PVDF 制成的膜。转渍蛋白质时，最常用的方法称为" 电印迹"(Electroblotting)，即运用电流，从凝胶中牵引出带负电荷的蛋白质，使其向带正电荷的阳极方向移动，进入 PVDF 或硝化纤维膜内。蛋白质自凝胶移入膜内时，可维持其在凝胶内形成的结构。较旧的转渍方法，则是在凝胶上先放一块膜，再放一叠滤纸，然后将其整叠移至缓冲溶液中，溶液在毛细管作用下会带动蛋白质，一同由下而上进入滤纸。但实际上由于耗时长，该方法并不常用。 不论采用何种方法，转渍完成后，蛋白质便会显露于薄膜上，可供检测。



在转渍时则需注意的点：

经电泳分离的蛋白需要转印到膜材质表面，以便后续抗体能与目的蛋白结合、检测。

转印膜要求柔韧易裁剪，耐化学试剂处理，可以长期保存，当然其中最重要的特性是蛋白载量高，以尽可能提高低丰度的蛋白的检测成功率。

大于 20KD 大小的蛋白选用 0.45um 膜，小于 20KD 大小的蛋白选用 0.2um 膜。

NC 膜价格低廉，无需活化即可使用，但在洗涤时易丢失小分子蛋白，膜韧性差易损坏;PVDF 膜较其他膜而言，灵敏度高、分辨率较好、与小分子蛋白结合能力较好。


阻拦

由于膜能结合蛋白质，所以抗体以及目标蛋白都可以结合到膜上，也因此我们必须防止膜和抗体的反应发生。把膜放在稀释的蛋白质溶液中（比如 3-5% 的牛血清蛋白、脱脂牛奶、TBS 或者 I-Block）可以阻挡非特定的结合。稀释溶液中的蛋白会把膜上没有与目标蛋白结合的地方全部结合，因此加了抗体之后，膜上就没有空间去结合其他非目标蛋白。阻拦是实验最后的铺垫，可以使结果更清晰，排除错误可能性。  


孵育一抗

将一抗用封闭液稀释（一般用封闭液稀释即可，如果背景不高用 TBST 稀释也可以，当然熟练后还可以自由发挥，配制一些自己的复方稀释液）至适当浓度（可以在 1.5 mlEP 管中配置工作液，常用稀释倍数为 1:200，1:500，1:1000，具体需要预实验进行摸索，用后可回收重复用 2～3 次，但回收重复利用的效果如何就要看抗体的质量，分装的抗体不推荐回收。稀释后应在 2－3 天内使用，4 度保存，避免反复冻融。）；撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡（也可使用手术室的病理袋，质量不错，减去下面的折叠部分，用封口器（40～80 元一个）封上，不漏液即可）。37°孵育 1 h 之后转移到室温下再孵育 1 h（或者 4°孵育过夜），用 TBST 在室温下脱色摇床上洗两次，每次 10 min；再用 TBS 洗一次，10 min。也可以多洗几次，比如 4 次，每次 5 min。


孵育二抗

在培养皿内加入二抗稀释液（10 ml 足够了，一般 1:1000 甚至 1:10000 用 TBST 稀释），放在摇床上，室温下孵育 1～2 h 后，用 TBST 在室温下脱色摇床上洗两次，每次 10 min；再用 TBS 洗一次，10 min，进行化学发光反应。选择好一个合适的条件不要轻易改变，另外相比一抗，二抗作用的时间应严格控制，实践证明一抗时间长点可能没什么关系，而二抗时间若过长过短都将会直接影响结果。二抗孵育之后还要注意好好洗涤，否则显影是背景可能脏。




分析

在未结合的探测剂被洗去之后，西方墨点法准备好检测被标记和结合到目标蛋白质的探测剂。在实际应用中，并不是所有的西方墨点法揭示蛋白质仅在一种膜上的一个条带。



在结果分析中往往会出现很多种比较奇怪的条带图案，我们往往可以从结果追寻到原因是什么操作导致结果失败的，接下来简要的介绍几种常见的实验失败结果

高背景



原因：封闭不够好，一抗浓度高，洗膜时间和次数不够

解决办法：降低一抗浓度，增加洗膜时间和次数。

出现许多条带



原因：一抗非特异性与蛋白结合

解决办法：更换一抗

条带中出现圆圈



原因：电转中膜和胶之间存在气泡。

解决办法：转膜前去掉膜和胶之间的气泡


分类

Western Blot 显色的方法主要有以下几种：

放射自显影

底物化学发光 ECL

底物荧光 ECF

底物 DAB 呈色

现常用的有底物化学发光 ECL 和底物 DAB 呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光 ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用 HRP 标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到 HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。


医学诊断应用

确证 HIV 检测采用 Western 印迹法以检测在人血清样品中的抗-HIV 抗体。

Western 印迹法还用作决定性测试牛海绵状脑病（BSE，通常被称为「疯牛病」）。

某些形式的莱姆病检测用 Western 印迹法。

Western 印迹法也可以被用来作为乙型肝炎病毒感染的确定测试。

在兽医中，Western 印迹法有时被用于确认猫的猫免疫缺陷病毒 FIV+状态


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